اصول و روش رنگ آمیزی بافت گیاهی
هدف از رنگ آمیزی :
رنگ آمیزی بافت های گیاهی به دو منظور انجام می شود :
۱.پدیدار ساختن قسمت هایی که در حالت عادی شفاف و نامرئی هستند.
2. مشخص کردن یک جز از اجزای دیگر.
ثابت کننده ها :
مواد رنگی هم در واقع شامل ترکیباتی هستند که درون اجزای مقطع و سلول ها نفوذ می کنند و چون انواعی از آنها از لحاظ شیمیایی نیز واکنش هایی با اجزای سلول ها و مقاطع انجام می دهند ، تاثیری دائمی بر مقاطع می گذارند برای رنگ آمیزی بافت های قبل از مقطع گیری اندام مورد مطالعه را در محلول های ثابت کننده بیندازید . این محلول ها سلول های زنده را می کشد در نتیجه قابلیت نفوذپذیری دیواره سلولی در برابر رنگ ها افزایش می یابد و در عین حال مواد ثابت کننده باعث می شوند که اجزای سلولی به همان شکل ساختمانی که در حالت زنده داشته باقی بمانند . یکی از ثابت کننده های مهم الکل است . اندام مورد نظر را به مدت ۲۴ ساعت در الکل اتیلیک یا الکل متیلیک قرار دهید که در این صورت الکل آب اندام ها را گرفته و آنها را برای مقطع گیری آماده می کند .
انواع رنگ آمیزی :
رنگ آمیزی ساده: انجام رنگ آمیزی به وسیله یک رنگ
رنگ آمیزی مضاعف: انجام رنگ آمیزی به وسیله دو نوع رنگ
رنگ آمیزی ساده:
در این روش که به منظور مطالعه چگونگی وضع یک نوع بافت بکار می رود برش تهیه شده را پس از بیرنگ کردن با آب ژاول به مدت نیم تا یک دقیقه در محلول یک رنگ ساده می گذارند.ونوع بافت مورد نظر را با توجه به رنگی که گرفته است تشخیص می دهند. مثلاً بافت های چوبی یا چوب پنبه و کوتین با محلول رقیق بلودو متیلن به رنگ آبی در می آیدو بر دیواره سلولزی سلول ها اثر ندارد وبافت های سلولزی بامحلول قرمز کنگو به رنگ قرمز در می آیند.
رنگ آمیزی مضاعف یا مرکب:
در این روش ابتدا برش ها را در یک محلول رنگ کننده بافت چوبی وچوب پنبه ای مانند آبی متیل ،سبز متیل یا فوشین قرار می دهند وسپس آن ها را با یک محلول رنگ کننده با فت سلولزی مانند کارمن زاجی یا قهوه ای بیسمارک یا قرمز کنگو رنگ می کنند. رنگ آمیزی مضاعف چند نوع است که متداول ترین روش آن در ادامه خواهد آمد.
شرح آزمایش رنگ آمیزی 1:
مواد و وسایل لازم :
۱. دو عدد شیشه ساعت
۲. آب مقطر
3.بلودومتیلن ، سبزید یا فوشین آمونیاکی
4.تیغ برای مقطع گیری
دستور کاررنگ آمیزی :
۱.قرار دادن مقاطع در شیشه ساعت حاوی محلول رقیق بلودومتیلن به مدت نیم تا یک دقیقه
۲. شست و شو مقاطع باآب
توجه :
برای رنگ آمیزی با سبزید مقاطع را به مدت یک دقیقه در محلول سبزید5/0 درصد برای رنگ آمیزی با فوشین آمونیاکی مقاطع را به مدت چند ثانیه در محلول فوشین آمونیاکی قرار داده وسپس شستشو می دهیم
نتیجه آزمایش :
۱. بلودومتیلن چوب ، چوب پنبه و کوتین را آبی رنگ و بر دیواره های سلولزی سلول ها اثری ندارد .
۲. سبزید بافت های چوب ، چوب پنبه و کوتین را به رنگ سبز متمایل به آبی در می آورد .
۳. فوشین آمونیاکی بافت های چوب ، چوب پنبه و کوتین را به رنگ قرمز در می آورد .
شرح آزمایش رنگ آمیزی 2 : روش کار و نتایج مهم !!!
مواد و وسایل لازم :
۱. نه عدد شیشه ساعت
۲. یک عدد تیغ برای مقطع گیری
۳. آب مقطر
۴. آب ژاول
۵. اسید استیک
۶. آبی متیل یا سبزید یا فوشین آمونیاکی (برای تشخیص بافت های چوبی و چوب پنبه ای)
۷. کارمن زاجی (برای تشخیص بافت های سلولزی)
دستورکاررنگ آمیزی :
در این نوع رنگ آمیزی دو دسته اصلی بافت ها (بافت های چوبی و سلولزی) از هم متمایز می شوند که برای این کار از دو رنگ استفاده می شود که یکی سلولز و دیگری چوب ، چوب پنبه و کوتین را رنگ آمیزی می کند
مراحل رنگ آمیزی مضاعف:
۱. قرار دادن مقاطع میکروسکوپی (برش ها) در آب ژاول به مدت ۲۰- ۱۵ دقیقه
2.شستشو مقاطع با آب مقطر
۳. قرار دادن مقاطع در اسید استیک ۱% به مدت ۲- ۱ دقیقه
۴. شستشو مقاطع با آب مقطر
۵.قرار دادن مقاطع در محلول سبزید یا آبی متیل به مدت20 ثانیه
۶. شستشو مقاطع با آب مقطر
۷. قرار دادن مقاطع در محلول کارمن زاجی به مدت 20- 15 دقیقه
۸.شستشو مقاطع با آب مقطر
نتیجه آزمایش :
۱. سلول های دارای دیواره سلولزی مانند پارانشیم ، کلانشیم ، آوندهای آبکشی و فیبر سلولزی به وسیله کارمن زاجی به رنگ قرمز متمایل به نارنجی در می آیند .
۲. بافت های چوبی ، چوب پنبه ای و کوتینی توسط سبزید یا آبی متیل به رنگ سبز یا آبی متمایل به سبز در می آیند .
توجه:
- علت قرار دادن برش هادر آب ژاول از آن جهت انجام می شود که از خاصیت رنگ بری این ماده استفاده شود تا نور بتواند از بافت های رنگی نمونه عبور کند.
- چون این ماده دارای خاصیت قلیائی بوده برای رفع این مشکل ( خنثی کردن اثر آب ژاول) برش ها را به مدت ۲ الی ۳ دقیقه در اسید استیک می خوابانیم.
- از مرحله اول تا انتهای مرحله پنجم رنگ آمیزی ساده و از مرحله اول تا انتهای مرحله هفتم رنگ آمیزی مضاعف نامیده میشود .
